ΟΛΟΚΛΗΡΩΘΗΚΕ Η ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ DNA ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ

ΤΙ ΓΝΩΡΙΖΑΜΕ ΓΙΑ ΤΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ. Το ανθρώπινο γονιδίωμα (human genome) είναι το σύνολο των αλληλουχιών των νουκλεϊνικών οξέων στους ανθρώπους, κωδικοποιημένο ως DNA σε 22 ζεύγη αυτοσωματικών χρωμοσωμάτων και ΧΧ στις γυναίκες και ΧΥ στους άνδρες στον κυτταρικό πυρήνα και σε ένα μικρό μόριο DNA που βρίσκεται στα μιτοχόνδρια (κληρονομούνται μόνο από τη μητέρα στα παιδιά). Αυτά συνήθως εξετάζονται ξεχωριστά ως το πυρηνικό και το μιτοχονδριακό γονιδίωμα. Οι πρώτες αλληλουχίες ανθρωπίνου γονιδιώματος δημοσιεύτηκαν σε πλήρως πρόχειρη μορφή τον Φεβρουάριο του 2001 στα περιοδικά Nature και Science ανεξάρτητα από το Κρατικά χρηματοδοτούμενο Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) και την ιδιωτική εταιρεία Celera Corporation. Το 2003 ολοκληρώθηκε και δημοσιεύτηκε το έργο της αλληλούχησης του ανθρώπινου γονιδιώματος από τη συνεργασία του Κρατικά Χρηματοδοτούμενου Προγράμματος Ανθρώπινου Γονιδιώματος με την ιδιωτική εταιρεία Celera Corporation. Λόγω μεθοδολογικών περιορισμών είχε ολοκληρωθεί κυρίως η αλληλούχηση των ευχρωματικών περιοχών (χαλαρά συσπειρωμένη μορφή DNA) των χρωμοσωμάτων και λιγότερο των ετεροχρωματινικών (έντονα συσπειρωμένη μορφή DNA). Ως εκ τούτου ο Άτλας του DNA του ανθρώπου είχε κάποια απροσδιόριστα κενά ή ακόμη και λάθη.

Το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει αλληλουχίες που κωδικοποιούν πρωτεΐνη (περίπου 1,5%), καθώς και πολυάριθμες τάξεις που δεν κωδικοποιούν RNA (π.χ. tRNA και rRNA), ψευδογονιδία, εσώνια, αμετάφραστες περιοχές του mRNA, ρυθμιστικές αλληλουχίες DNA, επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA και αλληλουχίες σχετικές με μεταθετά γενετικά στοιχεία. Οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA αποτελούν περίπου το 50% του ανθρωπίνου γονιδιώματος. Περίπου το 8% του ανθρωπίνου γονιδιώματος αποτελείται από διαδοχικές σε σειρά συστοιχίες DNA ή διαδοχικές επαναλήψεις, αλληλουχίες επανάληψης χαμηλής πολυπλοκότητας που έχουν πολλαπλά γειτονικά αντίγραφα (π.χ. “CAGCAGCAG…”). Οι διαδοχικές αλληλουχίες μπορεί να είναι μεταβλητών μηκών, από δύο νουκλεοτίδια μέχρι δεκάδες νουκλεοτίδια. Πιστεύαμε ότι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες και γι΄ αυτό είχαν ονομαστεί άχρηστο DNA (junk DNA). Η άποψη περί άχρηστου DNA άρχισε να χάνει έδαφος όταν αποκαλύφθηκε ο καθαρός όγκος αυτού του DNA στα κύτταρά μας. Όταν λοιπόν το 2001 ολοκληρώθηκε η αλληλούχηση του γονιδιώματος του ανθρώπου, μια από τις μεγαλύτερες εκπλήξεις ήταν η ανακάλυψη ότι το «άχρηστο», το μη κωδικό DNA καταλαμβάνει το 98% του κυτταρικού DNA του ανθρώπου.

ΜΕΤΑΘΕΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ. Τα μεταθετά γενετικά στοιχεία, που είναι αλληλουχίες DNA που μπορούν να αναδιπλασιαστούν και να εισάγουν αντίγραφα του εαυτού τους σε άλλες θέσεις στο γονιδίωμα, είναι άφθονα στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Το πιο πλούσιο προγονικό μεταθετόνιο, Alu, έχει περίπου 50.000 ενεργά αντίγραφα, και μπορεί να εισαχθεί σε ενδογονιδιακές και διαγονιδιακές περιοχές. Μια άλλη οικογένεια, η LINE-1, έχει 100 περίπου ενεργά αντίγραφα ανά γονιδίωμα. Μαζί με μη λειτουργικά απομεινάρια των παλιών μεταθετονίων, συναντώνται σε πάνω από το μισό ανθρώπινο DNA. Τα μεταθετόνια έχουν παίξει βασικό ρόλο στη γλυπτική του ανθρωπίνου γονιδιώματος και μερικές φορές ονομάζονται “jumping genes (γονίδια που πηδούν)”. Μερικές από αυτές της αλληλουχίες αντιπροσωπεύουν ενδογενείς ρετροϊούς, αντίγραφα DNA των ιογενών αλληλουχιών που έχουν ενσωματωθεί μόνιμα στο γονιδίωμα και έχουν μεταβιβαστεί σε διαδοχικές γενιές.

Τα μεταθετά γενετικά στοιχεία στο ανθρώπινο γονιδίωμα μπορούν να ταξινομηθούν σε ρετρομεταθετόνια LTR (μακριάς τελικής επανάληψης) (8,3% του συνολικού γονιδιώματος), σε βραχέα διάσπαρτα πυρηνικά στοιχεία (SINEs) (13,1% του συνολικού γονιδιώματος) συμπεριλαμβανομένων στοιχείων Alu, μακρά διάσπαρτα πυρηνικά στοιχεία (LINEs) (20,4% του συνολικού γονιδιώματος) και μεταθετόνια DNA τάξης II (2,9% του συνολικού γονιδιώματος).

ΠΟΣΟ ΔΙΑΦΕΡΕΙ ΤΟ DNA ΑΝΑΜΕΣΑ ΣΕ ΔΥΟ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ;

Η ολοκλήρωση της ανάλυσης του γονιδιώματος (DNA) του ανθρώπου, το 2003, έδειξε ότι το DNA σε κάθε πυρήνα ανθρώπινου κυττάρου αποτελείται από 3 περίπου δισεκατομμύρια ζευγάρια νουκλεοτιδίων. Ακόμα και δύο τελείως ξένα μεταξύ τους άτομα έχουν ίδιες αλληλουχίες DNA σε ποσοστό περίπου 99,9%. Αν θεωρήσουμε ότι οι μέσες διαφορές ανάμεσα στο DNA δύο ξένων μεταξύ τους ανθρώπων είναι 0,1% του DNA τους, τότε οι συνολικές διαφορές μεταξύ τους είναι περίπου 3.200.000 νουκλεοτίδια ανά γονιδίωμα, δηλ. υπάρχει μία διαφορά στο DΝΑ δύο οποιωνδήποτε ατόμων κάθε 100 ζεύγη βάσεων.

ΤΙ ΝΕΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΠΑΡΕΧΕΙ Η ΝΕΑ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ. Ερευνητές στην κοινοπραξία Telomere-to-Telomere (T2T), μια διεθνή συνεργασία που περιλαμβάνει περίπου 30 ιδρύματα, έχουν συμπληρώσει αυτά τα κενά (8%). Στην διεθνή ερευνητική ομάδα συμμετείχε ο διεθνούς φήμης καθηγητής Στυλιανός Αντωναράκης της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Γενεύης.

Η Διεθνής ομάδα επιστημόνων ανακοίνωσε ότι διάβασε/αλληλούχησε το σύνολο του γονιδιώματος (DNA) του ανθρώπου – συμπεριλαμβάνοντας πια και το μέρος εκείνο (γύρω στο 8% του συνόλου) που έλειπε εδώ και 20 χρόνια. Οι ερευνητές πρόσθεσαν 200 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων DNA (σύνολο 3,055) και 115 γονίδια (σύνολο 19.969) που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Το επίτευγμα αυτό θα έχει πληθώρα πρακτικών συνεπειών, π.χ. στη μοριακή διάγνωση ασθενειών, στη στοχευμένη φαρμακευτική αγωγή, στην εξατομικευμένη ιατρική ανάλογα με το DNA ενός ατόμου, στην αναγεννητική ιατρική, κλπ.

Τα πολυάριθμα κενά (8% του γονιδιώματος) αφορούσαν** ετεροχρωματικά τμήματα, π.χ. τους κοντούς βραχίονες και των πέντε ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων, τα κεντρομέρη (Το κεντρομέρος είναι το σημείο συνένωσης των δύο χρωματίδων, που συνιστούν ένα χρωμόσωμα. Το κεντρομέρος συνδέεται με τις ίνες της ατράκτου και συμμετέχει στη φυσιολογική κίνηση του χρωμοσώματος κατά τη διάρκεια της μίτωσης και μείωσης. Κάθε χρωμόσωμα έχει ένα κεντρομέρος. Το κεντρομέρος δεν περιέχει γονίδια. Διακρίνεται ως μια πολύ συμπυκνωμένη και συσφιγμένη περιοχή του χρωμοσώματος, πάνω στην οποία ακουμπούν οι ίνες της ατράκτου κατά τη μίτωση) και τα τελομερή (βρίσκονται στο τέλος του χρωμοσώματος και προστατεύουν τη χρήσιμη γενετική πληροφορία από τη φθορά) του γονιδιώματος που είναι πολύ πιο δύσκολα στην αλληλούχηση του DNA τους λόγω των πολυάριθμων επαναλαμβανόμενων DNA και άλλων δυσεπίλυτων χαρακτηριστικών ακολουθιών. Οι περιοχές αυτές είναι θεμελιώδεις για τον τρόπο λειτουργίας του κυττάρου, και φυσικά για τη ζωή μας.

Σε νέο δημοσίευμα (27/5/2021), που βρίσκεται** υπό αξιολόγηση, προκειμένου να δημοσιευθεί σε επιστημονικό περιοδικό, τα κενά αυτά πλέον καλύφθηκαν χάρη σε νέες ισχυρότερες τεχνικές αλληλούχησης του DNA, οι οποίες αναπτύχθηκαν από τις ιδιωτικές εταιρείες: Pacific Biosciences (PacBio) των ΗΠΑ και Oxford Nanopore που εδρεύει στη Βρετανία. Οι τεχνολογίες τους για την αλληλούχηση του DNA έχουν πολύ συγκεκριμένα πλεονεκτήματα σε σχέση με τα καινοτόμα εργαλεία και μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνταν από τους ερευνητές. Η μία αφορά σε ένα σύστημα απεικόνισης που μπορεί να διαβάσει ταυτοχρόνως εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχιών DNA. Η δεύτερη τεχνολογία διεισδύει ανάμεσα στις αλληλουχίες του DNA μέσω πρωτεϊνικών πόρων ή νανοπόρων, διαβάζοντας από δεκάδες έως εκατοντάδες χιλιάδες βάσεων μέσω της μέτρησης των ανεπαίσθητων αλλαγών του ηλεκτρικού ρεύματος που συμβαίνει όταν διέρχονται νουκλεοτίδια. Με απλά λόγια, αναλύουν έως 20.000 βάσεις, ενώ οι συμβατικές μερικές εκατοντάδες βάσεις. Το γονιδίωμα αυτό ονομάστηκε T2T-CHM13.

Το τρέχον γονιδίωμα αναφοράς GRCh38.p13 περιέχει άγνωστες ακολουθίες σε ολόκληρο το γονιδίωμα (χρωμοσώματα), συμπεριλαμβανομένων νέων γονιδίων, περικεντρομερικών και υποτελομερικών περιοχών, τμηματικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, συστοιχίες ριβοσωματικού DNA (rDNA), διορθώσεις στις αλληλουχίες των τελομερών, κλπ. Μερικά από τα μεγαλύτερα κενά αναφοράς συμπεριέλαβε ολόκληρους τους βραχείς βραχίονες και των πέντε ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων (13, 14, 15, 21 και 22) και μεγάλες δορυφορικές συστοιχίες (π.χ. στα χρωμοσώματα 1, 9 και 16).

Στην περίπτωση των ακροκεντρικών, κάποια ακολουθία που περιλαμβάνεται στο κοντό βραχίονα του χρωμοσώματος 21 εμφανίζεται εντοπισμένο εσφαλμένα με αποτέλεσμα ψευδείς διπλασιασμούς γονιδίων..

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΕΡΩΤΗΜΑ: Πόσο σημαντικά είναι αυτά τα κομμάτια που λείπουν από το ανθρώπινο γονιδίωμα; Η κοινοπραξία αύξησε από 2,92 δισεκατομμύρια σε 3,055 δισεκατομμύρια τον αριθμό των βάσεων DNA (αύξηση 4,5%), ενώ ο αριθμός των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αυξήθηκε κατά 115 σε 19.969 (αύξηση μόνο 0,4%). Αυτό δεν σημαίνει, τόνισαν οι ερευνητές, ότι το έργο δεν θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε άλλες νέες πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που σχετίζονται με τον τρόπο ρύθμισης και έκφρασης των γονιδίων. Επιπρόσθετα, πιστεύαμε αυτές τις περιοχές ως μη λειτουργικές. Αλλά αυτό δεν ισχύει πλέον. Περιοχές με επαναλαμβανόμενες βάσεις DNA – όπως αυτές που λείπουν από το γονιδίωμα του 2013 – έκτοτε συνδέονται με πολλά ζητήματα υγείας, από τη αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση, ALS ή νόσος Λου Γκέριγκ (νόσος ALS, πλήττει τα νεύρα εγκεφάλου, εγκεφαλικού στελέχους και νωτιαίου μυελού που ελέγχουν εκούσιες κινήσεις και ουσιαστικά χάνεται η δυνατότητα μετάδοσης νευρικών σημάτων από τα παραπάνω όργανα στους μύες, διαπιστώθηκαν επεκτάσεις επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών DNA), την ασθένεια Huntington (νευροεκφυλιστική ασθένεια του εγκεφάλου, γονίδιο φέρει επαναλήψεις της τριπλέτας Κυτοσίνης- Αδενίνης – Γουανίνης), έως τον καρκίνο (ορισμένες σύντομες, επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του DNA, ή «άχρηστου DNA», διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου των οστών). Με την αλληλουχία τους, ίσως να είμαστε καλύτερα εξοπλισμένοι για να μελετήσουμε και να αντιμετωπίσουμε αυτές τις καταστάσεις.

ΓΙΑΤΙ ΧΡΕΙΑΣΤΗΚΑΝ 20 χρόνια για να προσδιοριστεί αυτό το τελευταίο 8% του γονιδιώματος, ακόμα και όταν το κόστος της αλληλούχησης του υπόλοιπου γονιδιώματος μειώθηκε από 300 εκατομμύρια δολάρια σε μόλις 300 $; Οι τρέχοντες DNA μεθοδολογίες αλληλούχησης λαμβάνουν μικρά κομμάτια DNA, αποκωδικοποιούν και επανασυναρμολογούν το προκύπτον παζλ. Αυτό λειτουργεί καλά για το μεγαλύτερο μέρος του γονιδιώματος, αλλά όχι σε περιοχές όπου οι αλληλουχίες DNA είναι το αποτέλεσμα μακρών επαναλαμβανόμενων μοτίβων. Αυτό ήταν το 8% του γονιδιώματος που έλειπε. Αντίθετα, οι νέες τεχνικές επιτρέπουν την ταυτόχρονη αλληλούχηση μέχρι 20,000 ζευγαριών βάσεων.

ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΡΑΜΜΗ που χρησιμοποιήθηκε. Αυτή τη φορά, αντί να πάρουν DNA από ένα ζωντανό κύτταρο, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν μια κυτταρική σειρά που προέρχεται από ένα τύπο ιστού που σχηματίζεται όταν ένα σπέρμα γονιμοποιεί ένα ωάριο χωρίς πυρήνα. Το προκύπτον κύτταρο περιέχει χρωμοσώματα μόνο από τον πατέρα, οπότε οι ερευνητές δεν χρειάζεται να κάνουν διάκριση μεταξύ δύο ομάδων χρωμοσωμάτων από διαφορετικά άτομα.

ΚΕΝΑ. Περίπου το 0,3% του γονιδιώματος ίσως περιέχει λάθη, ενώ δεν έχει ολοκληρωθεί η αλληλούχηση του DNA του χρωμοσώματος Υ, που πυροδοτεί την ανάπτυξη του ανδρικού φύλου.

ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ. Η ερευνητική ομάδα T2T εργάζεται ήδη, σε συνεργασία με την Κοινοπραξία Αναφοράς του Ανθρώπινου Παν-γονιδιώματος (Human Pangenome) να μελετήσει 350 ακολουθίες ανθρώπινου γονιδιώματος, καθεμία από αυτές αντιπροσωπεύει ανθρώπους από διαφορετικό προγονικό υπόβαθρο, καθώς και να ολοκληρώσει την αλληλούχηση του χρωμοσώματος Υ.

*Βιβλιογραφία. *Nuck S. The complete sequence of a human genome. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.05.26.445798v1

**Graham F. 1/6/2021. Daily briefing: ‘Complete’ human genome sequence unveiled. Nature, https://www.nature.com/articles/d41586-021-01488-9