elgavrilis's blog

Το DNA είναι το μόριο της κληρονομικότητας σε όλους τους προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στους ιούς το γενετικό υλικό είναι είτε DNA είτε RNA. Όλα τα κυτταρικά DNA αποτελούνται από δύο πολύ μακριές ελικοειδείς πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες περιελιγμένες γύρω από έναν κοινό άξονα. Οι δύο αλυσίδες της διπλής έλικας στρέφονται σε αντίθετες κατευθύνσεις. Ο κορμός των σακχάρων-φωσφορικών της κάθε αλυσίδας είναι στο εξωτερικό της διπλής έλικας, ενώ οι βάσεις (πουρίνες και πυριμιδίνες) είναι στο εσωτερικό. Οι δύο αλυσίδες συγκρατούνται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των ζευγών των βάσεων. Η αδενίνη (Α) πάντα ζευγαρώνει με θυμίνη (Τ) και η γουανίνη (G) με κυτοσύνη (C). Επομένως η μία αλυσίδα της διπλής έλικας είναι συμπληρωματική της άλλης. Οι γενετικές πληροφορίες κωδικοποιούνται από την ακριβή αλληλουχία των βάσεων κατά μήκος της αλυσίδας. Τα περισσότερα μόρια DNA είναι κυκλικά. Ο άξονας της διπλής έλικας ενός κυκλικού DNA μπορεί και αυτός να ελιχθεί και να φτιάξει μια υπερέλικα. Τα υπερελικωμένα DNA είναι πιο συμπαγή απ’ ότι τα χαλαρά μόρια DNA.

Στην αντιγραφή του DNA, οι δύο αλυσίδες της διπλής έλικας ξεδιπλώνονται και ξεχωρίζουν καθώς συντίθενται νέες αλυσίδες. Κάθε μητρική αλυσίδα λειτουργεί ως εκμαγείο για τη δημιουργία μιας νέας συμπληρωματικής αλυσίδας. Επομένως η αντιγραφή του DNA είναι ημισυντηρητική – κάθε θυγατρικό μόριο παίρνει μια αλυσίδα από το μητρικό μόριο DNA. Η αντιγραφή του DNA είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που απαιτεί τη συμμετοχή πολλών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων και αρκετών DNA πολυμερασών. Οι ενεργοποιημένες πρόδρομες ενώσεις στη σύνθεση του DNA είναι οι τέσσερις 5’-τριφωσφορικοί δεοξυροβονουκλεοζίτες. Η νέα αλυσίδα συντίθεται στην κατεύθυνση 5’è3’ με πυρηνόφιλη προσβολή από το 3’-υδροξυλικό άκρο της αλυσίδας εκκίνησης προς το πιο εσωτερικό από τα άτομα φωσφόρου του τριφωσφορικού δεοξυριβονουκλεοζίτη που προστίθεται. Το πιο σημαντικό σημείο αυτής της διαδικασίας είναι ότι οι DNA πολυμεράσες καταλύουν τη δημιουργία ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού μόνο αν η βάση του νουκλεοτιδίου που εισέρχεται είναι συμπληρωματική της βάσης της αλυσίδας του εκμαγείου. Με άλλα λόγια, οι DNA πολυμεράσες είναι ένζυμα που κατευθύνονται από εκμαγεία.

Μερικοί ιοί έχουν μονή έλικα DNA για ένα διάστημα του κύκλου ζωής τους. Το DNA στον φΧ174, έναν μικρό ιό που μολύνει το βακτήριο E coli, είναι μονόκλωνο. Μέσα στον μολυσμένο ξενιστή όμως, συντίθεται μια συμπληρωματική αλυσίδα για να προκύψει ένα διπλοελικωμένο ενδιάμεσο αντιγραφής. Τα γονίδια ορισμένων ιών, όπως του μωσαϊκού του καπνού, αποτελούνται από απλή αλυσίδα RNA. Μια RNA-κατευθυνόμενη RNA-πολυμεράση κατευθύνει την αντιγραφή του ιϊκού RNA. Οι ογκογόνοι RNA ιοί, όπως ο ιός σαρκώματος Rous, αντιγράφονται μέσω διπλοελικωμένων ενδιάμεσων DNA. Το RNA αυτών των ογκογόνων ιών μεταγράφεται σε DNA από την αντίστροφη μεταγραφάση, μια DNA πολυμεράση που κατευθύνεται από RNA. Αυτοί οι ογκογόνοι RNA ιοί είναι γνωστοί και ως ρετροϊοί επειδή η γενετική πληροφορία σ’ αυτούς ρέει από το RNA στο DNA, το αντίστροφο δηλαδή απ’ ότι στην κανονική κατεύθυνση.

Η απομόνωση μιας πρωτεΐνης είναι απαραίτητη για τον προσδιορισμό της δομής και της λειτουργίας της. Οι πρωτεΐνες μπορούν να απομονωθούν από άλλες πρωτεΐνες και άλλα μόρια γενικότερα, βάσει χαρακτηριστικών τους όπως το μέγεθος, η διαλυτότητα, το φορτίο και η ικανότητα δέσμευσης. Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου-SDS διαχωρίζει τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες πρωτεϊνών που έχουν αποδιαταχθεί, κυρίως βάσει της μάζας τους. Οι πρωτεΐνες μπορούν επίσης να διαχωριστούν ηλεκτροφορητικά βάσει του φορτίου τους με ισοηλεκτρική εστίαση σε μια βαθμίδωση pH. Η υπερφυγοκέντρηση και χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή διαχωρίζουν τις πρωτεΐνες βάσει μεγέθους, ενώ η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής τις διαχωρίζει κυρίως βάσει του φορτίου τους. Αυτό που εκμεταλλευόμαστε στη χρωματογραφία συγγένειας είναι η υψηλή συγγένεια πολλών πρωτεϊνών για ειδικές χημικές ομάδες. Σε αυτή την τεχνική, οι πρωτεΐνες δεσμεύονται στη στήλη που περιέχει κόκκους  συνδεδεμένους ομοιοπολικά με υπόστρωμα, αναστολέα, ή άλλες ομάδες που αναγνωρίζονται ειδικά από τις πρωτεΐνες.

Η σύσταση των αμινοξέων μιας πρωτεΐνης μπορεί να καθοριστεί με υδρόλυσή της στα αμινοξέα που την αποτελούν, με 6Ν HCl στους 110 ⁰C. Τα αμινοξέα μπορούν να διαχωριστούν με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και να προσδιοριστούν ποσοτικά μετά από αντίδρασή τους με νινυδρίνη ή φθορεσκαμίνη. Οι αλληλουχίες αμινοξέων μπορούν να προσδιοριστούν με αποικοδόμηση κατά Edman, που απομακρύνει ένα αμινοξύ τη φορά από το αμινοτελικό άκρο του πεπτιδίου. Το φαίνυλοισοθειοκυανικό αντιδρά με την τελική αμινομάδα σχηματίζοντας ένα φαινυλοθειοκαρβαμοϋλο-παράγωγο που κυκλοποιείται κάτω από ελαφρά όξινες συνθήκες και δίνει ένα φαινυλόθειο-ϋδαντοϊνο(PTH)-αμινοξύ και ένα πεπτίδιο μικρότερο κατά ένα αμινοξύ. Αυτό το PTH-αμινοξύ προσδιορίζεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Αυτοματοποιημένες επαναλήψεις αποικοδόμησης Edman σε ένα μηχάνημα προσδιορισμού αλληλουχίας αμινοξέων μπορούν να ταυτοποιήσουν αλληλουχίες έως και 50 καταλοίπων. Οι μεγαλύτερες πολυπεπτιδικές αλυσίδες διασπώνται σε μικρότερες για ανάλυση μετά από εξειδικευμένη διάσπαση με αντιδραστήρια όπως το βρωμιούχο κυάνιο, που διασπά τους πεπτιδικούς δεσμούς στην καρβοξυλική πλευρά της μεθειονίνης. Ένζυμα όπως η θρυψίνη, που διασπά το καρβοξυτελικό άκρο της λυσίνης και της αργινίνης, είναι επίσης χρήσιμα στη διάσπαση των πρωτεϊνών. Οι τεχνικές του ανασυνδυασμένου DNA έχουν φέρει επανάσταση στον τρόπο ανάλυσης της αλληλουχίας των αμινοξέων. Η αλληλουχία των μορίων DNA αποκαλύπτει την αλληλουχία αμινοξέων των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από τα αντίστοιχα τμήματα DNA, αλλά δεν δίνει πληροφορίες για μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Οι αλληλουχίες αμινοξέων είναι πλούσιες σε πληροφορίες που σχετίζονται με τη συγγένεια των πρωτεϊνών, την εξελικτική τους σχέση και τις ασθένειες που προκύπτουν από τις μεταλλάξεις. Η γνώση της αλληλουχίας δίνει πολύτιμες πληροφορίες για τη διαμόρφωση και τη λειτουργία της πρωτεΐνης.

Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες μπορούν να συντίθενται με αυτοματοποιημένες μεθόδους στερεάς φάσης, όπου το καρβοξυτελικό άκρο μιας αλυσίδας δεσμεύεται σε κατάλληλο υπόστρωμα. Η α-καρβοξυλομάδα του επόμενου αμινοξέος ενεργοποιείται με δικυκλοεξυλοκαρβοδιϊμίδιο και ενώνεται στην α-αμινομάδα της αλυσίδας που αυξάνει. Τα συνθετικά πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φάρμακα και ως αντιγόνα για την παραγωγή ειδικών αντισωμάτων. Επίσης μας παρέχουν τρόπους ανάλυσης της σχέσης της αλληλουχίας των αμινοξέων και της διαμόρφωσης της πρωτεΐνης.

Οι πρωτεΐνες μπορούν να ανιχνευθούν και να προσδιοριστούν ποσοτικά με αντισώματα υψηλής συγγένειας. Η ενζυμοσύνδετη ανοσοπροσροφητική μέτρηση (ELISA) και η ανοσοαποτύπωση πηκτής πολυακρυλαμιδίου-SDS έχουν ευρεία χρήση. Οι πρωτεΐνες μπορούν επίσης να εντοπιστούν μέσα στο κύτταρο με μικροσκοπία φθορισμού, και ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία με τη χρήση σημασμένων αντισωμάτων. Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ έχει αποκαλύψει την τρισδιάστατη δομή περισσοτέρων από 200 πρωτεϊνών σε ατομική λεπτομέρεια. Η γνώση της μοριακής δομής έχει διευρύνει την κατανόησή μας στο πως αναδιπλώνονται οι πρωτεΐνες, πως αναγνωρίζουν άλλα μόρια και πως καταλύουν χημικές αντιδράσεις.